| 產(chǎn)品名 | TSAPLus熒光雙重染色試劑盒 |
| 別名 | |
| 英文名 | |
| CAS號 | |
| 分子式 | |
| 分子量 | |
| EINECS編號 | |
| MDL號 |
iF488-Tyramide 25 μL
iF555-Tyramide 25 μL
Tyramide稀釋液 100 mL
DAPI（即用型） 10 mL
組織自發(fā)熒光淬滅劑（蘇丹黑） 10 mL
抗熒光淬滅封片劑 5 mL
自備材料：
1. 自備0.01 mol/L PBS緩沖液（pH7.0-7.4），3% H2O2和0.3% H2O2；
2. 自備一抗及相應(yīng)HRP標(biāo)記二抗，抗原修復(fù)液（根據(jù)抗體及組織類型選擇合適的抗原修復(fù)液）；
3. 根據(jù)用量，按照下表比例配制TSA染色工作液。
注：熒光Tyramide融化后離心機(jī)短時(shí)離心，干凈吸頭吹吸混勻后取用。TSA染色工作液建議現(xiàn)配現(xiàn)用，需4℃避光保存，24h內(nèi)有效。
注意事項(xiàng)
1. 與熒光二抗相比，TSA試劑盒有更高的靈敏度和更強(qiáng)的信號。因此一抗使用濃度需降低，一般在抗體說明書建議的稀釋比基礎(chǔ)上再擴(kuò)大5-10倍，以減少非特異性結(jié)合導(dǎo)致的背景熒光。建議設(shè)置一抗梯度濃度獲得最佳效果。
2. 如背景熒光較強(qiáng)，建議增加組織自發(fā)熒光淬滅步驟。
3. 熒光Tyramide的建議稀釋比是1:500，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整稀釋比例（調(diào)整范圍1:200 - 1:1000）。
4. 如進(jìn)行多重?zé)晒鈽?biāo)記，建議先孵育多抗，后孵育單抗；先孵育高豐度目的蛋白對應(yīng)的抗體，再孵育低豐度目的蛋白對應(yīng)的抗體。
操作步驟
以組織切片為例，以下實(shí)驗(yàn)步驟中的實(shí)驗(yàn)用水均為純水：
1. 組織切片脫蠟至水；
2. 抗原修復(fù)：根據(jù)所使用的一抗及樣本類型，采用合適方式對組織切片進(jìn)行抗原修復(fù)；
3. PBS清洗3次，每次5 min，然后用免疫組化筆對組織畫圈標(biāo)記；
4. 滅活內(nèi)源性過氧化物酶：向切片上滴加3% H2O2覆蓋組織，室溫避光孵育25 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，以減少非特異性背景染色。PBS清洗3次，每次5 min；
5. 封閉：切片水分稍微甩干后，向組織上滴加3%BSA或血清封閉30 min，具體根據(jù)一抗及二抗種屬決定封閉試劑；
6. 一抗孵育：用PBS（或其他抗體稀釋液）將一抗稀釋至適當(dāng)濃度。輕輕甩掉切片上的液體，滴加稀釋好的一抗覆蓋組織，切片平放于加水的濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。PBS清洗3次，每次5 min；
7. 對應(yīng)HRP二抗孵育：用PBS（或其他抗體稀釋液）將二抗稀釋至適當(dāng)濃度，向組織上滴加二抗，室溫孵育50 min。PBS清洗3次，每次5 min；
8. 向組織上滴加50-100μL TSA-488染色工作液確保完全覆蓋組織，室溫避光孵育10 min。PBS清洗3次，每次5 min；
9. 微波處理：組織切片置于盛滿抗原修復(fù)液（根據(jù)組織類型及抗體選擇合適的抗原修復(fù)液）的修復(fù)盒中進(jìn)行微波加熱處理，去除已經(jīng)結(jié)合的一抗二抗。（加熱的溫度和時(shí)間建議：加熱到95℃以上，維持15分鐘。）此步驟中需防止液體過度蒸發(fā)導(dǎo)致的干片。
10. 重復(fù)步驟6，進(jìn)行第二個(gè)一抗的孵育：用PBS（或其他抗體稀釋液）將需檢測的第二個(gè)抗體（一抗）稀釋至適當(dāng)濃度。輕輕甩掉切片上的液體，滴加稀釋好的抗體覆蓋組織，切片平放于加水的濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。PBS清洗3次，每次5 min；
11. 重復(fù)步驟7，進(jìn)行對應(yīng)HRP二抗孵育：用PBS（或其他抗體稀釋液）將二抗稀釋至適當(dāng)濃度，向組織上滴加二抗，室溫孵育50 min。PBS清洗3次，每次5 min；
12. 向組織上滴加50-100μL TSA-555染色工作液確保完全覆蓋組織，室溫避光孵育10 min。PBS清洗3次，每次5 min；
13. 細(xì)胞核復(fù)染DAPI：切片稍甩干后在組織上滴加DAPI（即用型）染色液，避光室溫孵育10 min。PBS清洗3次，每次5min；
14. 組織自發(fā)熒光淬滅（可選）：向組織上滴加組織自發(fā)熒光淬滅劑（蘇丹黑），室溫孵育5 min，流水沖洗3 min；
15. 封片及鏡檢：切片稍甩干后滴加抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像。切片置于避光切片盒內(nèi)4℃可保存15天。
儲存與運(yùn)輸：試劑盒內(nèi)各組分按各自所需條件保存，冰袋（wet ice）運(yùn)輸。12個(gè)月有效。
COA搜索：
客服一
13813788405